Skip to content

Zakrzepica z mutacji protrombiny, która przenosi oporność na antytrombinę AD 2

1 miesiąc ago

411 words

U 100 Japończyków z prawidłowym fenotypem oraz u 5 osób z uprzednio nierozpoznaną zakrzepicą żył głębokich (DVT). Panel D przedstawia analizę kinetyki tworzenia kompleksu trombina-antytrombina (TAT) zrekombinowanych protrombiny typu dzikiego i p.Arg596Leu w obecności i nieobecności heparyny. Poziomy TAT mierzono za pomocą testu immunoenzymatycznego związanego z enzymem i różnych czasów inkubacji dla antytrombiny i rekombinowanych trombin; te ostatnie są formami zrekombinowanych protrombin aktywowanych przez czynnik Xa. Probandem była 17-letnia Japonka, która miała pierwszy epizod zakrzepicy żył głębokich w wieku 11 lat i od tego czasu była leczona warfaryną. Jej rodzina wywodzi się z Yukuhashi w północnej części wysp Kyushu. Co najmniej dziewięciu członków jej rodziny miało jeden lub więcej epizodów zakrzepicy żył głębokich (ryc. 1A), w tym dwa z zatorowością płucną i trzema, którzy zmarli na skutek zakrzepicy. Pięciu członków rodziny, w tym proband, miało zakrzepicę młodzieńczą, z dwoma epizodami reportażowymi we wczesnym dzieciństwie. Poprzednie badania nie wykazały żadnych znanych przyczyn dziedzicznej trombofilii w tej rodzinie
Metody
Analiza DNA
Zamplifikowaliśmy wszystkie 14 eksonów, w tym granice egzon-intron i region 3 nieulegający translacji, genu protrombiny za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), stosując startery specyficzne dla genu (patrz Tabela S1 w Dodatku dodatkowym, dostępnym z pełny tekst tego artykułu na). Amplikony sekwencjonowano tak, jak opisano poprzednio. Aby wykryć mutację, przeprowadziliśmy analizę polimorfizmu długości fragmentów DNA (RFLP) z zastosowaniem niedopasowanego dolnego startera (5 -TGTAGAAGCCATATTTCCCcTgC-3 , z substytucjami zasad dla c i g ) i wprowadzenie miejsca PstI do amplikonu ze zmutowanego allelu. Genomowy DNA wyizolowano z obwodowych leukocytów przez ekstrakcję fenolową.6
Rekombinowane protrombiny
Zastosowaliśmy test PCR do przygotowania pełnej długości ludzkiego komplementarnego protrombiny DNA (cDNA) uzyskanego z biblioteki cDNA ludzkiej wątroby (Clontech) i sklonowano ją do pcDNATM3.1 (+) (Invitrogen), aby uzyskać ludzki wektor ekspresji protrombiny typu dzikiego . Następnie przygotowaliśmy zmutowany protonowy wektor do ekspresji protrombiny za pomocą PCR typu overlap extension 7, stosując dwa startery: 5 -TGAAGGCTGTGACCtGGATGGGAAA-3 (sensowny starter z podstawieniem zasad w t) i 5 -TTTCCCATCCaGGTCACAGCCTTCA-3 (antysensowny starter z podstawienie zasad w punkcie a).
Transfekowaliśmy ludzką embrionalną komórkę nerkową (HEK293) za pomocą wektorów ekspresyjnych protrombiny stosując metodę fosforanu wapnia. Ustaliliśmy stabilne transformanty przez selekcję z G418 i ustaliliśmy, który z nich miał wysoki poziom ekspresji protrombiny za pomocą testu immunologicznego dot-blot.
[przypisy: leczenie kanałowe, stomatologia Kraków, stomatolog zielona góra ]