Skip to content

Zakrzepica z mutacji protrombiny, która przenosi oporność na antytrombinę AD 3

1 miesiąc ago

112 words

Kondycjonowane pożywki stabilnych transformantów eksprymujących rekombinowane protrombiny w pożywce bez surowicy zawierającej witaminę K zebrano, zatężono i przechowywano w -80 ° C aż do użycia. Ustaliliśmy poziomy antygenów w protrombinach przy użyciu testu immunoenzymatycznego (ELISA, Enzyme Research Laboratories). Funkcjonalne testy rekombinowanych protrombiny
Przeprowadziliśmy trzy testy aktywności protrombiny: jednoetapowy test krzepnięcia, dwustopniowy test krzepnięcia i test chromogenny, który wykorzystuje S-2238 (substrat trombiny, który generuje kolor w momencie cięcia). W dwóch ostatnich testach użyliśmy jadu Oxyuranus scutellatus (Sigma Aldrich) jako enzymu podobnego do Xa. Aby zbadać funkcje rekombinowanych protrombiny w osoczu, przygotowaliśmy odtworzone osocze przez zmieszanie plazmy z niedoborem protrombiny (aktywność protrombiny, <1%, Mitsubishi Chemical Medience) z rekombinowanymi protrombins przy założeniu, że stężenie protrombiny wynosi 100 ug na mililitr w normalne osocze (100%) 9 Osocze probandowe nie było odpowiednie do oceny z powodu leczenia warfaryną.
Formacja kompleksu trombina-antytrombina
Aby ocenić zdolność dzikiego i zmutowanego rekombinowanego protrombiny do tworzenia kompleksów z antytrombiną, przekształciliśmy rekombinowane protrombiny w trombiny, stosując czynniki bydlęce Xa (Haematologic Technologies) i Va (Thermo Scientific), cefalinę (Roche Diagnostica Stago), i chlorek wapnia. Następnie inkubowaliśmy trombiny z ludzką antytrombiną (Mitsubishi Tanabe Pharma), z lub bez niefrakcjonowanej heparyny (Mochida Pharmaceutical), w 37 ° C przez różne okresy czasu. Reakcje zatrzymano za pomocą PPACK (keton dikrofenyloalanylo-L-prolilo-L-argininowy) (Calbiochem), a tworzenie kompleksu trombina-antytrombina mierzono za pomocą zestawu AssayMax Human TAT Complexes ELISA (Assaypro).
Test generowania trombiny
Przygotowaliśmy osocze dzikiego typu, zmutowane i heterozygotyczne, przez zmieszanie plazmy z niedoborem protrombiny z rekombinowanymi protrombiny, przy końcowym stężeniu protrombiny wynoszącym 100% i przez zmieszanie osocza zubożonego w antytrombinę (Affinity Biologicals) z ludzką antytrombiną, końcowe stężenie antytrombiny 50%. Jako kontrolę używaliśmy normalnej puli plazmy. Test generowania trombiny przeprowadzono za pomocą kalibrowanej zautomatyzowanej trombografii (CAT, Thrombinoscope BV), zgodnie z instrukcjami producenta. Monitorowaliśmy reakcje przez 2 godziny, stosując Fluoroscan Ascent FL (Thermo LabSystems), nastawiony na wzbudzenie o długości fali 390 nm i długości fali emisji 460 nm oraz oprogramowanie Thrombinoscope (Thrombinoscope BV).
Przestudiuj badanie
Badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyczną w Wyższej Szkole Medycznej Uniwersytetu w Nagoya
[podobne: stomatolog zielona góra, promazyna, dentysta bielsko ]